一、未检测到洗脱靶蛋白
抗体原因
1.抗体量不足以捕获靶蛋白。
核查是否使用了推荐的抗体浓度，保证有充足的抗体捕获抗原，可适当增加抗体使用量，

2.抗原抗体不能相互识别。
抗原抗体不能相互识别是未检测到洗脱靶蛋白的重要原因，导致抗原抗体不能结合通常有以下原因：

裂解液或者缓冲液改变了靶蛋白的天然构像，或者抗体不能识别天然构象的靶蛋白，尽可能购买经过厂家验证过的抗体。例如部分免疫印迹抗体仅识别变性后的抗原。

使用合适的抗体，确保使用浓度，保质期等，确保使用抗体活性。

样品及试剂问题
3. 细胞抗原表达量低，或者不表达。
确保样品细胞的靶蛋白表达。如果目标蛋白在样品中低水平表达，可以增加样品的裂解量，并确保裂解充分，使得裂解物中含有充足的靶蛋白。

4. 确保细胞裂解时加入新鲜的蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。

5. 珠子结合抗体亲和力低，导致抗体未与珠子结合。
实验流程问题
6. 靶蛋白没有从磁珠中洗脱出来
检查是否使用了正确的洗脱缓冲液，缓冲液的浓度和pH值正好适合洗脱靶蛋白。在某些情况下，抗原与抗体或结合蛋白结合之间可能会发生极强的相互作用，传统的洗脱缓冲液无法将其破坏。

二、 高背景
1. 抗体非特异性结合
BSA没有预封闭全部的珠子，导致非目标蛋白与柱子的结合。
使用过多抗体导致非特异性结合。
细胞过多或裂解液中蛋白质过多导致非特异性结合。

2. 不溶于溶剂的蛋白质的遗留物
离心后立即移取上清，保留不溶性蛋白在离心管底部。

3. 洗涤不充分
离心前，将样品充分混匀，充分冲洗，减少杂质干扰。

4. 如果使用亲和纯化柱来富集目标蛋白，但仍出现高背景，可能是由于非特异性结合或交叉反应导致。尝试添加更多的洗脱步骤或增加洗脱缓冲液的浓度，减少添加到磁珠的样本量。

5. 样品存在污染
污染物如细菌、真菌、其他蛋白质等可以引起实验中的高背景。解决方法包括：使用无菌试剂和设备，注意实验操作的无菌性，进行适当的洗涤步骤以去除污染物。
三、 靶蛋白被抗体重链或轻链干扰

变性后的一抗IgG 轻链和重链分子量约为 25 和 50 kDa ，可能掩盖分子量相似的靶标蛋白条带。可以使用一下方式进行优化实验：

1. 改变抗体物种来源：使用不同物种的抗体用于 IP 和蛋白质印迹法，避免交叉反应，例如使用小鼠抗体用于免疫共沉淀，羊抗体用于免疫印迹。

2. 使用特殊标签的抗体：增加一抗特异性标签，使用针对特异性标签的二抗，例如使用his或bio标记抗体，检测生物素化抗体的二抗。

3. 根据抗体构象进行区分：使用特殊的二抗，例如仅识别非还原抗体的二抗，而不与还原后的抗体结合，使用这种类型的二抗可以有效避免无效结合造成的实验干扰。
4. 根据抗体分子量进行区分：如果我们靶蛋白在25kd附近没有条带，可以使用轻链二抗进行结合。

四、 大量抗体被洗脱
1. 优化抗体浓度：尝试减少抗体的使用量，以减少非特异性结合。逐渐降低抗体浓度并进行实验，观察结果是否改善。

2. 优化洗涤缓冲液：使用含有适当浓度的洗涤缓冲液，对洗脱步骤进行优化。可能需要尝试不同的洗涤缓冲液成分和浓度来降低非特异性结合。

3. 更换缓冲液：使用了高强度洗脱缓冲液导致多种非特异蛋白与抗原一起被洗脱下来。应改用使用温和的甘氨酸缓冲液梯度洗脱。

4. 引入阻断剂：添加合适的阻断剂，来减少非特异性结合。这些阻断剂可以占据未结合的位点，降低抗体与非特定蛋白质的结合。
五、 非特异结合条带或多个杂带
抗体原因
1. 抗体或载体可能会非特异性地结合其他蛋白质，导致背景信号增加，影响结果的准确性。
在免疫沉淀前预处理裂解物，添加合适的溶液或酶以降低背景信号。

2. 使用单克隆抗体
使用的抗体特异性不强，尝试更换特异性更强的抗体进行实验。使用的抗体是经过验证的，具有特异性和高亲和力。经过验证的抗体可以显著降低非特异性结合。

3. 使用太多抗体导致非特异性结合。
减少抗体的使用量，一般是因为抗体浓度过高导致的。
样品问题
1. 样品裂解液中含有太多蛋白，超出柱子或者磁珠结合负载，导致洗脱液中很多杂质蛋白。
2. 抗原样品在实验时未加入蛋白酶抑制剂，发生降解。
3. 抗原存在同工型蛋白包含多种蛋白同工型或剪接变体，它们可以迁移至不同的分子量。翻译后修饰 (PTM) 会导致部分靶蛋白的电泳速率与未修饰蛋白不同。

实验流程的原因
1. 封闭不足
珠子用BSA预封闭不充分，导致样品和柱子的非特异性结合或者使用Nonidet P-40（NP-40）等去结合剂，解离膜蛋白，减少非特异性结合。

2. 充分洗涤
增加洗涤次数或使用更严格的洗涤缓冲液，以减少非特异性结合和假阳性结果的发生。