一、 一、免疫荧光浅或不显色
抗体原因
1. 一抗及二抗本身抗体问题，一抗特异性差，或者一抗、二抗使用浓度过低，孵育时间不足等导致结合弱。

2. 一抗和二抗问题不能相互识别，如果一抗选择鼠源抗体，二抗选择抗兔抗体或识别其他物种抗体，导致二抗与一抗不能相互结合。建议严格按照说明书进行实验操作，可适当进行预实验，摸索孵育浓度和时间等。

样品及试剂问题
3. 切片过于陈旧
不同靶点蛋白在存放一段时间后对于抗体的结合活性可能存在不同的降解，甚至消失，如果切片需要保存，建议保存在4℃恒温环境中。

4. 检测试剂灵敏度不足，孵育时间过短等。

5. 细胞/组织切片本身抗原表达量低，或者不表达。

实验流程问题
6. 抗原修复不完全
对于石蜡切片进行抗原修复是实验的关键环节，抗原修复可使用热水浴、微波炉或高压锅，蛋白酶进行修复，保证缓冲体系最佳条件，一般可根据历史数据和文献资料自行选择，也可进行对比实验，摸索修复实验条件。（针对细胞爬片，抗原修复一般采用100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，pH 9.5进行热水浴10min，此步骤可选，以增加抗体的结合强度）

7. 荧光二抗损坏
使用二抗注意避光，固定样品时选择合适的固定方法：根据待检测物的性质和免疫荧光试剂的要求，选择合适的固定方法，如乙醇固定、冰乙酸固定等。
选择适当的酶解条件：如果必要，使用适当的酶解条件来处理样品，以保持荧光的完整性。

8. 固定时间过长
固定是为了防止离体组织自溶抗原扩散，但固定试剂选择不当使用浓度不合适，如使用多聚甲醛、甲醛，固定时间过长等会导致的抗原损伤，导致抗体结合差。

9. 细胞通透不足，导致抗体未能充足着色
为了使试剂和抗体在整个样品中充分渗透，通常使用Triton。保证玻片完全透化，建议使用浓度为0.5 - 1%。如果是膜表面抗原可省略。

10. 激发波长使用错误
确保激发波长与荧光基团相匹配。

二、 背景着色过深
1. 样品高背景
需要设置空白对照或者二抗孵育对照，防止样品自发荧光带来的背景，带来的高背景或者非特异性着色。如果样品背景高无法解决可考虑使用荧光猝灭剂：添加荧光猝灭剂，如溴化铯、酸性亮氨酸等，以减少背景荧光的干扰。

2. 实验流程中洗涤不充分
对于细胞爬片和组织切片在一抗孵育后或二抗孵育结束应当充分洗涤，增加洗涤次数，防止一抗或者二抗非特异性着色。

3. 切片封闭不足
保证细胞或组织切片封闭完全，在一抗孵育之前，使用合适的封闭液进行封闭，封闭液一般选择与二抗来源相同的种属，如二抗是羊抗兔，封闭液应选择羊血清。

4. 洗涤不充分
考虑增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间，避免清洗次数或者时间不足导致背景着色过深。

5. 机械损伤或者干片，脱蜡不完全导致的背景着色问题
在组织切片进行脱蜡处理时，应保证玻片温度合适，快速放入溶剂，进行脱蜡抗原修复，避免玻片出现干片现象，在湿盒中孵育抗体，避免样品干燥。

6. 抗体浓度使用过高
抗体浓度使用过高会导致背景值加深及非特异性着色。建议严格按照说明书建议浓度进行操作，实验前进行浓度滴定可有效防止浓度使用不当。

三、 组织切片脱片
组织在染色过程中如果发生脱片，主要是实验流程和使用材料引起的，可以优化以下条件：

1. 组织切片使用用含有多聚赖氨酸的玻片，使用带有极性具有高结合活力的载玻片，增加切片结合的稳定性。（细胞爬片可选择使用多聚赖氨酸的玻片或高吸附能力的爬片，防止细胞脱落）

2. 适当增加烤片时间，调整合适的温度，如果出现大规模脱片现象，往往是在实验流程中发生了问题，可以延长烤片时间和提高烤片温度；

3. 组织本身特性导致的脱片，例如骨组织等，除以上注意事项外，操作时PBS进行冲洗时，应尽量轻柔，避免对着样品直接冲洗，建议选择淋洗，减少物理冲击造成的脱片。

4. 进行抗原修复修复时，温度的短时间骤热骤冷导致的细胞脱片。

5. 使用抗原热修复及微波修复时，缓冲液爆沸导致的脱片。

四、 细胞/组织形态损伤
优化固定条件：选择合适的固定方法和固定时间，以最大程度保持细胞或组织结构的完整性。
1. 调整染色温度：降低染色温度可以减少细胞或组织结构的破坏。

2. 优化抗体和染色剂选择：选择适合特定细胞或组织类型的抗体和染色剂，以提高染色效果并最小化结构破坏。

五、 细胞/组织切片存在非特异染色
抗体原因
1. 抗体使用浓度过高，抗体孵育时间过长容易增加背景着色。通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体浓度可有效减少非特异性结合。

2. 使用单克隆抗体
多克隆抗体虽然存在表位丰富，亲和力强等优点，但也会存在非特异性结合等现象，使用单克隆抗体可以有效避免这种原因导致的非特异性集合。

3. 对于二抗来源物种与检测样品来源物种相同的某些样品，可能含有FcR或者二抗可能会结合内源性 IgG，导致背景较高。

样品问题
1. 样品本身存在自发荧光，建议选择合适的荧光通道或者使用淬灭剂进行荧光淬灭。
2. 样品存在其他非特异结合原因，例如补体，电荷等，需要增加封闭时间，增加洗涤次数。

实验流程的原因
1. 封闭不足
一抗孵育之前，使用合适的封闭液进行封闭，封闭液一般选择与二抗来源相同的种属，如二抗是羊抗兔，封闭液应选择羊血清。

2. 样品干片
在整个实验流程中，应当严格控制孵育条件，避免出现试剂蒸发，流程等造成的干片。

3. 充分洗涤
增加洗涤次数或使用更严格的洗涤缓冲液，以减少非特异性结合和假阳性结果的发生。

4. 采集图像参数
选择合适的激发强度，曝光时间等对假阳性和非特异性结合有一定的优化效果。