一、 无信号
抗体原因
1. 确保按照抗体说明书保存抗体，注意保存条件，例如使用PE/APC等荧光标记抗体，应避免抗体冻融，PE-cy5染料应避免光照等

2. 抗体保质期和抗体使用浓度过低，导致信号低或没有信号
3. 对于一些低表达的靶点蛋白应使用荧光信号强的抗体，避免二抗使用错误
4. 检查使用了合适的二抗，区别于WB,IP选择FACS专用二抗

5. 一抗和二抗不能相互识别，如果一抗选择鼠源抗体，二抗选择识别其他物种抗体，导致二抗与一抗不能相互结合而没有信号
样品及试剂问题
6. 样品蛋白构象变化
样品经过固定，蛋白酶消化改变了细胞蛋白的天然构象，导致荧光抗体不能识别，应注意荧光抗体使用注意事项，例如分析CD40等蛋白靶点

7. 研究靶点在细胞内，未进行破膜或破膜不充分，导致抗体无法结合，选择小分子量荧光染料，增加抗体与靶点的结合

8. 蛋白本身抗原表达量低，或者不表达，或者需要经特定因子等诱导后表达；蛋白为分泌蛋白，在细胞膜不存在，蛋白胞外区较短，荧光抗体不能识别指定位点；靶点蛋白被内化，应注意孵育保存在4℃，可以查阅文献或者做预实验确认样品靶点表达丰度等信息

9. 选用合适的缓冲液，例如一些转录因子可能对PH，离子等敏感，应选用合适的缓冲液
实验流程问题
10. 固定时间太长，导致蛋白交联而影响荧光素的化学特性

11. 细胞样品使用合适的增益补偿，确保电压，通道等检测条件合适

12. 调整细胞密度和抗体孵育时间等，避免使用过多细胞，或者孵育时间不足等

13. 荧光试剂被固定试剂等破坏，例如应避免甲醇和PE染料接触

14. 激发波长使用错误
确保激发波长与荧光基团相匹配，通道和荧光补偿是否匹配等

二、 非特异性染色
1. 样品自发荧光
不同细胞，培养基，缓冲液可能导致不同的自发荧光，应设置未染色对照组排除样品带来的荧光信号

2. 细胞活性
一些死细胞自发荧光比较高，可能导致分析信号异常，可以选取死/活细胞染料进行区分

3. 抗体使用条件不合适
抗体浓度使用过高会导致背景值加深及非特异性着色。建议严格按照说明书建议浓度进行操作，实验前进行浓度滴定可有效控制信噪比。

4. 样品带有FcR
抗体Fc端与细胞结合导致非特异性染色，在分析髓系来源的细胞时，可以使用Fc封闭试剂进行封闭，但应注意封闭试剂与二抗没有交叉反应。同时避免使用花青素作为荧光染料分析有FcR表达的细胞样品

5. 洗涤不充分
考虑增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间，避免清洗次数或者时间不足导致非特异性结合

6. 非特异性染色可能是因为二抗非特异性结合导致的，建议增加样品加二抗孔作为实验对照，选择一种只与一抗反应、却不会与检测组织发生交叉反应的二抗

7. 补偿设置不合适
多通道之间发生荧光重叠，调节合适的电压和补偿，对于一些带有自发荧光标记的细胞，应注意调节和染料之间的补偿。

三、 高背景

1. 一些死细胞自发荧光比较高，可能导致分析信号异常，可以选取死/活细胞染料进行区分

2. 在分析一些特殊细胞时，例如粒细胞来源细胞，样品自发荧光比较高

3. 使用建议的抗体稀释度。使用较低的细胞数时，实验前可以自己进行滴定确定使用浓度
4. 建议使用特异性好的识别位点明确的二抗，避免荧光基团或二抗直接与细胞的结合，必要时可以使用直标抗体
5. 不正确的光学参数设置可能导致信号强度不足或背景噪音过高

四、 测向光异常
1. 细胞破碎
实验过程中应注意涡旋和离心速度，透化固定时间等，避免样品细胞破碎严重

2. 样品污染
样品保存不当，导致含有细菌等颗粒物质污染，导致样品收集过快，背景自发荧光等

3. 处理血液制品时，样品中可能含有红细胞碎片，血小板等杂质，可适当优化洗涤步骤降低杂质含量
五、 荧光信号弱
1. 抗体结合不足
抗体结合不足，细胞上的信号将会减弱。可能的原因包括抗体浓度太低、结合时间不足等

2. 荧光标记抗体信号弱
荧光二抗保存不当，导致荧光强度减弱，荧光标记物质可能不稳定或者已经过期，导致信号强度减弱

3. 光电倍增管（PMT）设置不当 
流式仪器中的光电倍增管负责检测荧光信号，其灵敏度设置会影响信号强度。
4. 细胞使用量不足
流式细胞术的信号强度与细胞的浓度直接相关。如果样本中的细胞浓度太低，那么流式仪可能无法正确检测到足够的细胞，从而导致信号弱
5. 荧光通道和表达量不匹配
抗原表达丰度低，应当选取强荧光通道，如PE-CY7等，如果选取APC-H7可能导致信号

六、 样品收集个数异常
1. 细胞使用密度不足，导致收集不够，样品在洗涤过程中丢失，导致上样量不足

2. 流式细胞仪管道堵塞，未及时清理，或者制备的样品中又结团现象，导致堵塞机器，可以在上样前过滤样品，避免堵塞机器，某些细胞类型可能会在流式细胞仪的流动过程中沉淀到仪器的壁上，导致流速减慢或堵塞。这可能是由于细胞大小、浓度和表面特性等因素导致的

3. 使用仪器前使用QC样品检测机器运行，确保机器正常使用，有些使用蠕动泵进样机器蠕动管老化使用时间长存在老化等问题

4. 设置不当的流速和压力可能导致细胞聚集、沉淀或无法完全通过流式细胞仪或样品细胞量使用过大，导致收集样品过快