一、 组化着色浅甚至不显色
抗体原因
1. 一抗及二抗本身活性问题，例如抗体试剂本身活性不足，抗体不在保质期，抗体反复使用，抗体存在污染，抗体使用浓度不合适等；可以通过选择有质量保证和活性验证的抗体试剂，按照说明书进行操作。

2. 一抗和二抗问题一不能相互识别，例如一抗选择鼠源抗体，二抗选择抗兔抗体或识别其他物种抗体，导致二抗与一抗不能相互结合。
样品及试剂问题
3. 切片过于陈旧，建议在4℃保存样品
4. 使用过于陈旧的样品，可能导致染色信号丢失，不同靶点蛋白在存放一段时间后对于抗体的结合活性可能存在不同的削弱，如果切片需要保存，建议保存在4℃恒温环境中。

5. 检测试剂灵敏度不足，时间不足等
6. 对于一些仅使用HRP标记的二抗可能存在信号检测弱的情况，可以使用更高灵敏度的二抗标记抗体，用于检测低表达靶点。

7. 组织切片本身抗原表达量低，或者不表达
8. 建议实验流程中设置阳性对照，排除实验流程，试剂使用不当导致的结果呈现阴性，在磷酸化等特定靶点可能存在真阴性样品的可能。
实验流程问题
9. 抗原修复不完全
抗原修复实验步骤中可使用热水浴、微波炉或高压锅，也可以使用蛋白酶进行修复，根据待检测靶点选择修复合适的试剂（酸碱修复等）保证缓冲体系最佳条件，一般建议使用微波加热方式进行抗原修复或者高压条件进行抗原修复，避免抗原修复不足及试剂原因导致的信号弱。

10. 固定时间过长
固定试剂选择不当使用浓度不合适等，如使用多聚甲醛、甲醛，也应该避免固定时间过长等导致的抗原损伤。

11. 细胞通透不足，导致抗体未能充足着色
为了使试剂和抗体在整个样品中充分渗透，通常使用Triton。保证玻片完全透化，建议使用浓度为0.5 - 1%。

12. 抗体孵育时间不足
一抗或者二抗在不同的孵育温度下，对应的孵育时间显著不同，一般在4℃过夜，可以保证充分结合。
二、 背景着色过深
1. 抗体使用不当导致背景着色过深
抗体工作浓度未按照说明书进行稀释，或者靶点表达丰度的影响未摸索使用浓度可能导致背景的非特异性着色，一抗或者二抗孵育温度及时间不合适导致背景着色升高，推荐孵育条件未4℃过夜孵育。

2. 显色试剂显色时间过长，未及时终止显色
显色时需要在镜下严格控制显色时间，而不能粗略的只计算显色时间。
3. 切片封闭不足
保证切片封闭完全，在一抗孵育之前，使用合适的封闭液进行封闭，封闭液一般选择与二抗来源相同的种属，如二抗是羊抗兔，封闭液应选择羊血清。

4. 考虑增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间，避免清洗次数或者时间不足导致背景着色过深。

5. 避免样品含有内源性抗原
在实验流程中一些背景信号可能来自样品本身。例如 使用HRP 检测系统，样品中的内源性过氧化物酶会产生十分强的背景信号，应提前进行消除内源性过氧化物酶处理；如果靶点是一些免疫球蛋白，可能导致二抗的假阳性信号等。

6. 机械损伤或者干片，脱蜡不完全导致的背景着色问题
在进行脱蜡处理时，应保证玻片温度合适，快速放入溶剂，进行脱蜡
在进行抗原修复，一抗孵育等环节避免玻片出现干片现象
三、 组织切片存在非特异染色
抗体原因
1. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。合适的抗体选择及孵育条件是非常重要的一条。

2. 使用单克隆抗体
多克隆抗体虽然存在表位丰富，亲和力强等优点，但也会存在非特异性结合等现象，使用单克隆抗体可以有效避免这种原因导致的非特异性集合。

3. 对于二抗来源物种与检测样品来源物种相同的某些样品，二抗可能会结合内源性 IgG，导致背景较高
实验流程的原因
4. 样品中含有内源性生物素，导致底物非特异显色
样品中的内源性过氧化物酶活性可能会产生过强的背景信号。

5. 封闭不足
一抗孵育之前，使用合适的封闭液进行封闭，封闭液一般选择与二抗来源相同的种属，如二抗是羊抗兔，封闭液应选择羊血清。

6. 显色试剂孵育时间过长或浓度过高；
使用HRP显色系统，DAB使用浓度过高，或者终止时间不合适导致的背景过深或者非特异性显色。

7. 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
在整个实验流程中，应当严格控制孵育条件，避免出现试剂蒸发，流程等造成的干片。

8. 充分洗涤对于比较低背景和强信号非常关键。
确保在步骤之间用PBS至少洗3次，去除其他试剂带来的影响，例如固定剂，过氧化氢等
四、 固定组织形态不完整
1. 固定不充分或者固定过度
确保样品已固定足够长的时间,以允许固定剂穿透样品。固定的时间可能需要一些优化。固定条件一般在4℃条件下进行。

2. 机械损伤
样品在处理时要将组织从一个小瓶移动到另一个小瓶,或者添加或移除试剂,使用去掉尖端的塑料巴斯德吸管(这可以防止吸管的狭窄末端对胚胎的任何损伤）。尽可能避免使用镊子。
五、 组织切片脱片

组织在染色过程中如果发生脱片，不仅会浪费珍贵的组织样品，而且耽误实验时间，一般造成组织脱片主要是实验流程和使用材料引起的。

1. 组织切片使用用含有多聚赖氨酸的玻片，使用带有极性具有高结合活力的载玻片，增加切片结合的稳定性。

2. 适当增加烤片时间，调整合适的温度，如果出现大规模脱片现象，往往是在实验流程中发生了问题，可以延长烤片时间和提高烤片温度；

3. 组织本身特性导致的脱片，例如骨组织等，除以上注意事项外，操作时PBS进行冲洗时，应尽量轻柔，避免对着样品直接冲洗，建议选择淋洗，减少物理冲击造成的脱片。

4. 进行抗原修复修复时，温度的短时间骤热骤冷导致的细胞脱片。

5. 使用抗原热修复及微波修复时，缓冲液爆沸导致的脱片。
六、 边缘效应
1. 组织边缘与玻片粘贴不牢，组织切片厚度不合适
制备粘附力强的玻片，控制组织切片厚度，不厚于4微米，组织的前期处理应避免选用坏死较多的组织，避免样品导致的脱落及边缘效应；

2. 切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，导致边缘出现干片进而出现边缘效应
试剂充分覆盖组织，应超出组织边缘。用组化笔画圈时，应距离样品合适的距离不要过近，一般控制在3mm左右即可。