一、 高背景（非目的条带处出现连续性弥散性条带）
分析高背景主要分为以下几种原因。
抗体原因
1. 使用过高的抗体浓度，导致抗体存在非特异性结合 
通过稀释抗体，降低一抗或二抗的浓度，或者通过梯度稀释抗体选择合适的抗体浓度。
膜及试剂选择本身问题
1. 封闭液选择不当 
脱脂牛奶及动物血清可能与不同一抗产生交叉反应，或者封闭液中含有生物素等原因导致非特异性显色。

2. 缓冲体系选择不当 
磷酸盐缓冲液（PBS）会干扰碱性磷酸酶的活性，当使用碱性磷酸酶，应避免使用含有磷酸盐的试剂。
检测磷酸化蛋白时，避免使用磷酸盐缓冲液（如 PBS）和含磷蛋白的封闭剂。

3. 膜污染导致背景值过高
通过避免膜污染，全程使用干净镊子。
换一张新膜用足够的液体，避免操作过程中膜干燥
实验中避免膜之间相互干扰，防止膜表面相互摩擦等物理损伤
选择合适孔径的纤维素膜

实验流程问题
1. 非特异性位点的不充分洗涤
增加封闭液中的蛋白浓度。
优化封闭时间和温度。在室温下封闭1-2 小时，或 4 ℃过夜。
漂洗不充分导致背景过高，增加漂洗次数和漂洗缓冲液的体积。
在封闭液中添加去垢剂帮助减少背景，去除非特异性结合。选择合适浓度的去垢剂可以有效降低条带背景
2. 化学发光底物的信号太强 
减少印迹曝光时间，减少较弱信号的显色程度。
当显色过于灵敏时，可以换用灵敏度更低的底物。
优化膜与底物的孵育时间等。
3. 调整一抗，二抗孵育时间，避免孵育时间过长。

二、 无信号或微弱条带
抗体原因
1. 一抗及二抗本身活性问题，例如抗体试剂本身活性不足，抗体不在保质期，抗体反复使用，抗体存在污染，抗体使用浓度不合适等；可以通过选择有质量保证和活性验证的抗体试剂，按照说明书进行操作。

2. 一抗和二抗问题一不能相互识别，例如一抗选择鼠源抗体，二抗选择抗兔抗体或识别其他物种抗体，导致二抗与一抗不能相互结合。

样品问题
1. 感兴趣的蛋白质不存在。
通过前期调查，确认样品中是否含有目的蛋白。
组织或细胞系中的蛋白表达水平是够较低
2. 样品中蛋白质不足
确保每条泳道至少上样 20–30 µg 蛋白质，使用蛋白酶抑制剂，避免样品提取过程中降解，例如磷酸化蛋白检测实验，蛋白提取过程中，需要添加磷酸酶抑制剂避免样品降解。
每次实验设置合适的系统对照，排除其他因素的影响。
3. 蛋白提取样品裂解不足
确保细胞中较难提取的膜结合和细胞器（如胞核和线粒体）的含量较少的蛋白过程中，确保样品被充分裂解是必不可少的。
4. 样品防止时间太久，导致样品降解，或者蛋白沉积等。

实验操作
1. 转膜过程中选择条件不合适，可以通过调整转膜时间，调整电压等条件
2. 转膜中温度过高，蛋白样品降解
3. 更换膜的类型（NC 与 PVDF），选择合适孔径的膜
4. 化学发光试剂灵敏度不足，甚至失效，或者显色时间较短
5. 洗涤过程中使用去垢剂浓度过高，或者洗涤次数多，时间过久等
6. 缓冲体系与检测二抗偶联酶不兼容。一些缓冲液含有可能干扰检测的试剂。例如，叠氮化钠是 HRP 的抑制剂，不适合与 HRP 偶联的二抗同时使用。

三、 非特异性或弥散条带
抗体原因
1. 抗体浓度过高 通过降低一抗使用浓度，降低非特异结合信号。使用经试验验证过的一抗。更换特异性更好的抗体。
2. 二抗非特异结合导致的背景信号，减少二抗使用浓度，特别是 HRP 或 AP 标记二抗的浓度。
3. 选择经交叉验证的二抗。避免使用物种相近，同源性高的物种产生的一抗。

样品原因
1. 凝胶孔上样量过高需要减少加入的样品量，减少样品的非特异性。
2. 化学发光底物的信号太强减少印迹的成像或曝光时间。
3. 蛋白存在不同亚型，或者变体，包含不同分子量同工蛋白，或者蛋白存在多聚体形式，还原不充分等，在上样品需要充分还原样品。
4. 缩短膜与底物的孵育时间。
5. 造成弥散性条带可能是电压过高，迁移速度过快，电泳温度过高等导致。 
四、 条带呈反白色.
当条带出现反白情况，往往是抗体浓度过高，底物被迅速消耗，在检测时剩余的光信号降低，在蛋白成像时导致中间低周围高，形成空心样品，或者白色样品，将抗体稀释至最佳浓度。
五、 拖尾效应
1. 糖基化蛋白
不同的糖基化导致分子量高于预测的分子量处产生条带拖尾效应。

2. 样品降解
样品中的蛋白酶抑制剂等有助于防止蛋白降解。裂解物的长时间存放导致蛋白降解物增加，在分子量低于预测分子量时出现拖尾效应。

3. 裂解不完全或者样品溶解度不好，优化蛋白样品提取方法，寻找合适的裂解方式

4. 电泳缓冲液重复利用次数过多，消耗过多的盐溶液。
5. 分离胶浓度不合适，导致蛋白分离效果不理想。
六、 散斑或斑点样印迹
1. 转移海绵污染，当转移海绵使用后没及时痛风晾干，可能生长真菌等板块。

2. 缓冲液污染，使用次数过多的缓冲液或者防止过久导致微生物滋生，使这些点状物显色在膜上形成斑点。
3. 封闭液溶解不充分，例如脱脂牛奶未溶解充分，含有颗粒样团块，导致封闭不完全。
七、 条带出现笑脸状

1. 迁移期间电压可能过高。未根据蛋白分子量选择合适的电压，导致蛋白迁移过快。

2. 电压太高，迁移速率太快，导致出现边缘效应，检查建议电压的协议，选择合适电压条件。

3. 凝胶在迁移过程中可能太热。如果温度过高，缓冲液的 pH 值可能会发生变化，导致蛋白迁移环境收到影响，可以在冰上后者4℃条件下进行电泳，保证环境温度。

4. 凝胶时间不充分，胶内部冷却密度不均匀或者甲醇浓度较低，可以适当提高甲醇浓度。