一、 组化着色浅甚至不显色

抗体原因

1. 一抗及二抗本身活性问题，例如抗体试剂本身活性不足，抗体不在保质期，抗体反复使用，抗体存在污染，抗体使用浓度不合适等；可以通过选择有质量保证和活性验证的抗体试剂，按照说明书进行操作。

2. 一抗和二抗问题一不能相互识别，例如一抗选择鼠源抗体，二抗选择抗兔抗体或识别其他物种抗体，导致二抗与一抗不能相互结合。

样品及试剂问题

3. 切片过于陈旧，建议在4℃保存样品

4. 使用过于陈旧的样品，可能导致染色信号丢失，不同靶点蛋白在存放一段时间后对于抗体的结合活性可能存在不同的削弱，如果切片需要保存，建议保存在4℃恒温环境中。

5. 检测试剂灵敏度不足，时间不足等

6. 对于一些仅使用HRP标记的二抗可能存在信号检测弱的情况，可以使用更高灵敏度的二抗标记抗体，用于检测低表达靶点。

7. 组织切片本身抗原表达量低，或者不表达

8. 建议实验流程中设置阳性对照，排除实验流程，试剂使用不当导致的结果呈现阴性，在磷酸化等特定靶点可能存在真阴性样品的可能。

实验流程问题

9. 抗原修复不完全

抗原修复实验步骤中可使用热水浴、微波炉或高压锅，也可以使用蛋白酶进行修复，根据待检测靶点选择修复合适的试剂（酸碱修复等）保证缓冲体系最佳条件，一般建议使用微波加热方式进行抗原修复或者高压条件进行抗原修复，避免抗原修复不足及试剂原因导致的信号弱。

10. 固定时间过长

固定试剂选择不当使用浓度不合适等，如使用多聚甲醛、甲醛，也应该避免固定时间过长等导致的抗原损伤。

11. 细胞通透不足，导致抗体未能充足着色

为了使试剂和抗体在整个样品中充分渗透，通常使用Triton。保证玻片完全透化，建议使用浓度为0.5 - 1%。

12. 抗体孵育时间不足

一抗或者二抗在不同的孵育温度下，对应的孵育时间显著不同，一般在4℃过夜，可以保证充分结合。

二、 背景着色过深

1. 抗体使用不当导致背景着色过深

抗体工作浓度未按照说明书进行稀释，或者靶点表达丰度的影响未摸索使用浓度可能导致背景的非特异性着色，一抗或者二抗孵育温度及时间不合适导致背景着色升高，推荐孵育条件未4℃过夜孵育。

2. 显色试剂显色时间过长，未及时终止显色

显色时需要在镜下严格控制显色时间，而不能粗略的只计算显色时间。

3. 切片封闭不足

保证切片封闭完全，在一抗孵育之前，使用合适的封闭液进行封闭，封闭液一般选择与二抗来源相同的种属，如二抗是羊抗兔，封闭液应选择羊血清。

4. 考虑增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间，避免清洗次数或者时间不足导致背景着色过深。

5. 避免样品含有内源性抗原

在实验流程中一些背景信号可能来自样品本身。例如 使用HRP 检测系统，样品中的内源性过氧化物酶会产生十分强的背景信号，应提前进行消除内源性过氧化物酶处理；如果靶点是一些免疫球蛋白，可能导致二抗的假阳性信号等。

6. 机械损伤或者干片，脱蜡不完全导致的背景着色问题

在进行脱蜡处理时，应保证玻片温度合适，快速放入溶剂，进行脱蜡

在进行抗原修复，一抗孵育等环节避免玻片出现干片现象

三、   组织切片存在非特异染色

抗体原因

1.   抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。合适的抗体选择及孵育条件是非常重要的一条。

2.   使用单克隆抗体

多克隆抗体虽然存在表位丰富，亲和力强等优点，但也会存在非特异性结合等现象，使用单克隆抗体可以有效避免这种原因导致的非特异性集合。

3.   对于二抗来源物种与检测样品来源物种相同的某些样品，二抗可能会结合内源性 IgG，导致背景较高

实验流程的原因

4.   样品中含有内源性生物素，导致底物非特异显色

样品中的内源性过氧化物酶活性可能会产生过强的背景信号。

5.   封闭不足

一抗孵育之前，使用合适的封闭液进行封闭，封闭液一般选择与二抗来源相同的种属，如二抗是羊抗兔，封闭液应选择羊血清。

6.   显色试剂孵育时间过长或浓度过高；

使用HRP显色系统，DAB使用浓度过高，或者终止时间不合适导致的背景过深或者非特异性显色。

7.   标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

在整个实验流程中，应当严格控制孵育条件，避免出现试剂蒸发，流程等造成的干片。

8.   充分洗涤对于比较低背景和强信号非常关键。

确保在步骤之间用PBS至少洗3次，去除其他试剂带来的影响，例如固定剂，过氧化氢等

四、 固定组织形态不完整

1.   固定不充分或者固定过度

确保样品已固定足够长的时间,以允许固定剂穿透样品。固定的时间可能需要一些优化。固定条件一般在4℃条件下进行。

2.   机械损伤

样品在处理时要将组织从一个小瓶移动到另一个小瓶,或者添加或移除试剂,使用去掉尖端的塑料巴斯德吸管(这可以防止吸管的狭窄末端对胚胎的任何损伤）。尽可能避免使用镊子。

五、 组织切片脱片

组织在染色过程中如果发生脱片，不仅会浪费珍贵的组织样品，而且耽误实验时间，一般造成组织脱片主要是实验流程和使用材料引起的。

1.   组织切片使用用含有多聚赖氨酸的玻片，使用带有极性具有高结合活力的载玻片，增加切片结合的稳定性。

2.   适当增加烤片时间，调整合适的温度，如果出现大规模脱片现象，往往是在实验流程中发生了问题，可以延长烤片时间和提高烤片温度；

3.   组织本身特性导致的脱片，例如骨组织等，除以上注意事项外，操作时PBS进行冲洗时，应尽量轻柔，避免对着样品直接冲洗，建议选择淋洗，减少物理冲击造成的脱片。

4.   进行抗原修复修复时，温度的短时间骤热骤冷导致的细胞脱片。

5.   使用抗原热修复及微波修复时，缓冲液爆沸导致的脱片。

六、 边缘效应

1.   组织边缘与玻片粘贴不牢，组织切片厚度不合适

制备粘附力强的玻片，控制组织切片厚度，不厚于4微米，组织的前期处理应避免选用坏死较多的组织，避免样品导致的脱落及边缘效应；

2.   切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，导致边缘出现干片进而出现边缘效应

试剂充分覆盖组织，应超出组织边缘。用组化笔画圈时，应距离样品合适的距离不要过近，一般控制在3mm左右即可。

一、 免疫荧光浅或不显色

抗体原因

1. 一抗及二抗本身抗体问题，一抗特异性差，或者一抗、二抗使用浓度过低，孵育时间不足等导致结合弱。

2. 一抗和二抗问题不能相互识别，如果一抗选择鼠源抗体，二抗选择抗兔抗体或识别其他物种抗体，导致二抗与一抗不能相互结合。建议严格按照说明书进行实验操作，可适当进行预实验，摸索孵育浓度和时间等。

样品及试剂问题

3. 切片过于陈旧

不同靶点蛋白在存放一段时间后对于抗体的结合活性可能存在不同的降解，甚至消失，如果切片需要保存，建议保存在4℃恒温环境中。

4. 检测试剂灵敏度不足，孵育时间过短等。

5. 细胞/组织切片本身抗原表达量低，或者不表达。

实验流程问题

6. 抗原修复不完全

对于石蜡切片进行抗原修复是实验的关键环节，抗原修复可使用热水浴、微波炉或高压锅，蛋白酶进行修复，保证缓冲体系最佳条件，一般可根据历史数据和文献资料自行选择，也可进行对比实验，摸索修复实验条件。（针对细胞爬片，抗原修复一般采用100 mM Tris，5% [w/v] 尿素，pH 9.5进行热水浴10min，此步骤可选，以增加抗体的结合强度）

7. 荧光二抗损坏

使用二抗注意避光，固定样品时选择合适的固定方法：根据待检测物的性质和免疫荧光试剂的要求，选择合适的固定方法，如乙醇固定、冰乙酸固定等。

选择适当的酶解条件：如果必要，使用适当的酶解条件来处理样品，以保持荧光的完整性。

8. 固定时间过长

固定是为了防止离体组织自溶抗原扩散，但固定试剂选择不当使用浓度不合适，如使用多聚甲醛、甲醛，固定时间过长等会导致的抗原损伤，导致抗体结合差。

9. 细胞通透不足，导致抗体未能充足着色

为了使试剂和抗体在整个样品中充分渗透，通常使用Triton。保证玻片完全透化，建议使用浓度为0.5 - 1%。如果是膜表面抗原可省略。

10.激发波长使用错误

确保激发波长与荧光基团相匹配。

二、 背景着色过深

1. 样品高背景

需要设置空白对照或者二抗孵育对照，防止样品自发荧光带来的背景，带来的高背景或者非特异性着色。如果样品背景高无法解决可考虑使用荧光猝灭剂：添加荧光猝灭剂，如溴化铯、酸性亮氨酸等，以减少背景荧光的干扰。

2. 实验流程中洗涤不充分

对于细胞爬片和组织切片在一抗孵育后或二抗孵育结束应当充分洗涤，增加洗涤次数，防止一抗或者二抗非特异性着色。

3. 切片封闭不足

保证细胞或组织切片封闭完全，在一抗孵育之前，使用合适的封闭液进行封闭，封闭液一般选择与二抗来源相同的种属，如二抗是羊抗兔，封闭液应选择羊血清。

4. 洗涤不充分

考虑增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间，避免清洗次数或者时间不足导致背景着色过深。

5. 机械损伤或者干片，脱蜡不完全导致的背景着色问题

在组织切片进行脱蜡处理时，应保证玻片温度合适，快速放入溶剂，进行脱蜡抗原修复，避免玻片出现干片现象，在湿盒中孵育抗体，避免样品干燥。

6. 抗体浓度使用过高

抗体浓度使用过高会导致背景值加深及非特异性着色。建议严格按照说明书建议浓度进行操作，实验前进行浓度滴定可有效防止浓度使用不当。

三、 组织切片脱片

组织在染色过程中如果发生脱片，主要是实验流程和使用材料引起的，可以优化以下条件：

1.   组织切片使用用含有多聚赖氨酸的玻片，使用带有极性具有高结合活力的载玻片，增加切片结合的稳定性。（细胞爬片可选择使用多聚赖氨酸的玻片或高吸附能力的爬片，防止细胞脱落）

2.   适当增加烤片时间，调整合适的温度，如果出现大规模脱片现象，往往是在实验流程中发生了问题，可以延长烤片时间和提高烤片温度；

3.   组织本身特性导致的脱片，例如骨组织等，除以上注意事项外，操作时PBS进行冲洗时，应尽量轻柔，避免对着样品直接冲洗，建议选择淋洗，减少物理冲击造成的脱片。

4.   进行抗原修复修复时，温度的短时间骤热骤冷导致的细胞脱片。

5.   使用抗原热修复及微波修复时，缓冲液爆沸导致的脱片。

四、 细胞/组织形态损伤

优化固定条件：选择合适的固定方法和固定时间，以最大程度保持细胞或组织结构的完整性。

1.   调整染色温度：降低染色温度可以减少细胞或组织结构的破坏。

2.   优化抗体和染色剂选择：选择适合特定细胞或组织类型的抗体和染色剂，以提高染色效果并最小化结构破坏。

五、 细胞/组织切片存在非特异染色

抗体原因

1.   抗体使用浓度过高，抗体孵育时间过长容易增加背景着色。通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体浓度可有效减少非特异性结合。

2.   使用单克隆抗体

多克隆抗体虽然存在表位丰富，亲和力强等优点，但也会存在非特异性结合等现象，使用单克隆抗体可以有效避免这种原因导致的非特异性集合。

3.   对于二抗来源物种与检测样品来源物种相同的某些样品，可能含有FcR或者二抗可能会结合内源性 IgG，导致背景较高。

样品问题

1.   样品本身存在自发荧光，建议选择合适的荧光通道或者使用淬灭剂进行荧光淬灭。

2.   样品存在其他非特异结合原因，例如补体，电荷等，需要增加封闭时间，增加洗涤次数。

实验流程的原因

1.   封闭不足

一抗孵育之前，使用合适的封闭液进行封闭，封闭液一般选择与二抗来源相同的种属，如二抗是羊抗兔，封闭液应选择羊血清。

2.   样品干片

在整个实验流程中，应当严格控制孵育条件，避免出现试剂蒸发，流程等造成的干片。

3.   充分洗涤

增加洗涤次数或使用更严格的洗涤缓冲液，以减少非特异性结合和假阳性结果的发生。

4.   采集图像参数

选择合适的激发强度，曝光时间等对假阳性和非特异性结合有一定的优化效果。

一、    高背景（非目的条带处出现连续性弥散性条带）

分析高背景主要分为以下几种原因。

抗体原因

1.  使用过高的抗体浓度，导致抗体存在非特异性结合

通过稀释抗体，降低一抗或二抗的浓度，或者通过梯度稀释抗体选择合适的抗体浓度。

膜及试剂选择本身问题

1.  封闭液选择不当

脱脂牛奶及动物血清可能与不同一抗产生交叉反应，或者封闭液中含有生物素等原因导致非特异性显色。

2.  缓冲体系选择不当

磷酸盐缓冲液（PBS）会干扰碱性磷酸酶的活性，当使用碱性磷酸酶，应避免使用含有磷酸盐的试剂。

检测磷酸化蛋白时，避免使用磷酸盐缓冲液（如 PBS）和含磷蛋白的封闭剂。

3.  膜污染导致背景值过高

通过避免膜污染，全程使用干净镊子。

换一张新膜用足够的液体，避免操作过程中膜干燥

实验中避免膜之间相互干扰，防止膜表面相互摩擦等物理损伤

选择合适孔径的纤维素膜

实验流程问题

1.  非特异性位点的不充分洗涤

增加封闭液中的蛋白浓度。

优化封闭时间和温度。在室温下封闭1-2 小时，或 4 ℃过夜。

漂洗不充分导致背景过高，增加漂洗次数和漂洗缓冲液的体积。

在封闭液中添加去垢剂帮助减少背景，去除非特异性结合。选择合适浓度的去垢剂可以有效降低条带背景

2.  化学发光底物的信号太强 

减少印迹曝光时间，减少较弱信号的显色程度。

当显色过于灵敏时，可以换用灵敏度更低的底物。

优化膜与底物的孵育时间等。

3.  调整一抗，二抗孵育时间，避免孵育时间过长。

二、    无信号或微弱条带

抗体原因

1.  一抗及二抗本身活性问题，例如抗体试剂本身活性不足，抗体不在保质期，抗体反复使用，抗体存在污染，抗体使用浓度不合适等；可以通过选择有质量保证和活性验证的抗体试剂，按照说明书进行操作。

2.  一抗和二抗问题一不能相互识别，例如一抗选择鼠源抗体，二抗选择抗兔抗体或识别其他物种抗体，导致二抗与一抗不能相互结合。

样品问题

1.  感兴趣的蛋白质不存在。

通过前期调查，确认样品中是否含有目的蛋白。

组织或细胞系中的蛋白表达水平是够较低

2.  样品中蛋白质不足

确保每条泳道至少上样 20–30 µg 蛋白质，使用蛋白酶抑制剂，避免样品提取过程中降解，例如磷酸化蛋白检测实验，蛋白提取过程中，需要添加磷酸酶抑制剂避免样品降解。

每次实验设置合适的系统对照，排除其他因素的影响。

3.  蛋白提取样品裂解不足

确保细胞中较难提取的膜结合和细胞器（如胞核和线粒体）的含量较少的蛋白过程中，确保样品被充分裂解是必不可少的。

4.  样品防止时间太久，导致样品降解，或者蛋白沉积等。

实验操作

1.  转膜过程中选择条件不合适，可以通过调整转膜时间，调整电压等条件

2.  转膜中温度过高，蛋白样品降解

3.  更换膜的类型（NC 与 PVDF），选择合适孔径的膜

4.  化学发光试剂灵敏度不足，甚至失效，或者显色时间较短

5.  洗涤过程中使用去垢剂浓度过高，或者洗涤次数多，时间过久等

6.      缓冲体系与检测二抗偶联酶不兼容。一些缓冲液含有可能干扰检测的试剂。例如，叠氮化钠是 HRP 的抑制剂，不适合与 HRP 偶联的二抗同时使用。

三、    非特异性或弥散条带

抗体原因

1.  抗体浓度过高  通过降低一抗使用浓度，降低非特异结合信号。使用经试验验证过的一抗。更换特异性更好的抗体。

2.  二抗非特异结合导致的背景信号，减少二抗使用浓度，特别是 HRP 或 AP 标记二抗的浓度。

3.  选择经交叉验证的二抗。避免使用物种相近，同源性高的物种产生的一抗。

样品原因

1.  凝胶孔上样量过高需要减少加入的样品量，减少样品的非特异性。

2.  化学发光底物的信号太强减少印迹的成像或曝光时间。

3.  蛋白存在不同亚型，或者变体，包含不同分子量同工蛋白，或者蛋白存在多聚体形式，还原不充分等，在上样品需要充分还原样品。

4.  缩短膜与底物的孵育时间。

5.  造成弥散性条带可能是电压过高，迁移速度过快，电泳温度过高等导致。

四、    条带呈反白色.

当条带出现反白情况，往往是抗体浓度过高，底物被迅速消耗，在检测时剩余的光信号降低，在蛋白成像时导致中间低周围高，形成空心样品，或者白色样品，将抗体稀释至最佳浓度。

五、    拖尾效应

1.  糖基化蛋白

不同的糖基化导致分子量高于预测的分子量处产生条带拖尾效应。

2.  样品降解

样品中的蛋白酶抑制剂等有助于防止蛋白降解。裂解物的长时间存放导致蛋白降解物增加，在分子量低于预测分子量时出现拖尾效应。

3.  裂解不完全或者样品溶解度不好，优化蛋白样品提取方法，寻找合适的裂解方式

4.  电泳缓冲液重复利用次数过多，消耗过多的盐溶液。

5.  分离胶浓度不合适，导致蛋白分离效果不理想。

六、    散斑或斑点样印迹

1.  转移海绵污染，当转移海绵使用后没及时痛风晾干，可能生长真菌等板块。

2.  缓冲液污染，使用次数过多的缓冲液或者防止过久导致微生物滋生，使这些点状物显色在膜上形成斑点。

3.  封闭液溶解不充分，例如脱脂牛奶未溶解充分，含有颗粒样团块，导致封闭不完全。

七、    条带出现笑脸状

1.  迁移期间电压可能过高。未根据蛋白分子量选择合适的电压，导致蛋白迁移过快。

2.  电压太高，迁移速率太快，导致出现边缘效应，检查建议电压的协议，选择合适电压条件。

3.  凝胶在迁移过程中可能太热。如果温度过高，缓冲液的 pH 值可能会发生变化，导致蛋白迁移环境收到影响，可以在冰上后者4℃条件下进行电泳，保证环境温度。

4.  凝胶时间不充分，胶内部冷却密度不均匀或者甲醇浓度较低，可以适当提高甲醇浓度。