WB制膜的标准操作程序

1、目  的：建立制膜的标准操作程序。

2、范  围：适用于制膜操作。                                   

3、责任者：制膜操作人员。

4、程  序：

 4.1 计划

  4.1.1 制膜信息分别来自抗原及免疫组，抗体检定组，质量检测组等。

  4.1.2 来自免疫组，抗体检定组，质量检测组的制膜信息分别在公共数据库的免疫&AC膜预约表，QC膜预约表中，要求每个工作日看一次，免疫组，质量检测组制好的膜直接交付项目负责人并在预约表中登记，AC预约膜及其他部门预约的补充膜库的膜均放入膜库并在AC膜登记表上登记。

  4.1.3 来自质量检测组的制膜信息，要求保留全分子量，同时有特殊要求的膜，使用梯度胶进行电泳。制好的膜直接交付当事人。现重组蛋白的膜设置了梯度，以检测抗体亲和力。

  4.1.4 综合上述制膜信息，分轻重缓急和当时情况，制订好第二天的做膜计划，从裂解液库找出样品，使用后要求登记在裂解液登记表中。

 4.2 制胶

  4.2.1 使用之前确保用具都是干燥和干净的，如果刚从烘箱拿出，要使所有用具先回复到室温。松掉灌胶器的螺帽，取下挡板。接下来就是做三明治，即依次放上长玻璃片、短玻璃片和隔片（隔片第一次使用时，注意先把隔片上的保护膜取下）（隔片有厚薄之分，一般一个灌胶器需要十厚三薄，有时需临时调整），这样就构成一个三明治，要注意使每片要抵到内壁，不要留下缝隙。安装好所有的三明治，一般是12-13个三明治。在放最后一块隔片时，先将灌胶器的有螺帽面朝上，再小心放上隔片，务必使之不超出灌胶器内壁的边缘。

  4.2.2 小心插入挡板，注意不要造成三明治的移动。稍拧紧螺帽，再将灌胶器正放，对角用力拧紧螺帽。要求是灌胶器与挡板松紧合适，灌胶前试插一下梳子。

  4.2.3 灌胶：选定合适的高度（使浓缩胶的宽度留有0.75cm-1cm）。配好分离胶，每个灌胶器一般需84ml，用50ml注射器从灌胶器的上部灌入，灌胶时速度要缓慢均匀，不要突然加快，并注意减少气泡；但也不要太慢，在胶凝聚之前结束灌胶。

  4.2.4 立即用正丁醇（正丁醇量请参照附表5）封住。分离胶凝固后（约40min-1hr），倾倒封层并清洗，尽量除去残留水分。制备堆积胶，按照配方配好除APS和TEMED的所需试剂，准备好梳子后，加入APS和TEMED，混匀后用10ml注射器灌到已凝固的分离胶的上面，一般每个分离胶需1.5ml，即注射器上三个刻度，立即斜插入梳子，以驱赶气泡，室温下凝固40-60min后即可用。一般胶凝聚过夜至第二天使用。

  4.2.5 梯度胶灌制：配制好4%的轻溶液55ml，20%的重溶液55ml，不用加入SDS，连接好灌胶器和梯度生成仪附件，把轻重溶液分别倒入梯度生成仪的轻重容器中，先打开灌胶器开关，然后打开轻重容器混合开关，等胶灌满灌胶器，关闭灌联并立即插入梳子。

 4.3 电泳

  4.3.1 Ag处理：加样前需在95-100℃水浴加热5min。细胞或组织裂解液（已预先定量总蛋白量为1mg/ml或2mg/ml）按每张胶200ug的量上样，如 一孔梳每孔200ug，两孔梳每孔100ug，10孔梳每孔20ug。若是重组蛋白，按每块胶200ng上样。

  4.3.2 装配好电泳装置，在Marker泳道加入4-5ul Protein Marker,加相应的lysate到上样泳道。

  4.3.3 内外槽加上预冷的电泳buffer，内槽注满，外槽加高于玻璃板底部位置。开始电泳，电泳条件一般为150V。 电泳时间根据Protein Marker的位置确定，一般14% 的胶溴酚蓝跑到胶底（未跑出）停止；10%的胶15KDa的marker跑出去（保留20KDa）停止；8%的胶25KDa的marker跑出去（保留37KDa）停止；6%的胶50KDa的marker跑出去（保留75KDa）停止。一般1h-1.5h。

4.4 电转

  4.4.1 在前一天即可准备电转buffer，含有10%甲醇的1×电转缓冲液配好后，置于4℃预冷过夜。12块胶（一个电转槽）一般需准备3.5L。

  4.4.2 在电泳结束前30min，按每4块电泳胶需2张膜四张滤纸算，准备好所需的滤纸数。把滤纸和海绵浸入电转buffer中备用。

  4.4.3 膜的处理，裁出合适大小的PVDF膜，以一定斜角慢慢浸入100%甲醇，务必使膜全部浸湿，处理20sec。处理时手不要去接触膜，用镊子接触膜，夹在膜的边缘处。倒去甲醇，去离子水换洗3次后，加水振摇2min。尽量倒尽水，将膜浸入电转buffer，注意浸没，平衡30min以上。

  4.4.4 此后撬开玻板取出胶，剔除浓缩胶，如有需要，可在分离胶的边角切角作为识别标志。如果是两孔梳，要求切出两孔。小心剥离出分离胶，置于电转buffer平衡40min。如果一次平衡很多胶，要求合理分开时间段，以使相同的胶的平衡条件尽量一致（以一个十二道电泳仪为单位，共十二块胶，先平衡4块胶，20min后再平衡剩下的8块胶）。

  4.4.5 预冷后，换上新手套，先在合适的载体上，如合适大小的盒盖，放好胶夹，阳极面朝下，铺上一张海绵，海绵不要沥的太干。在海绵上铺上一张滤纸，用玻棒推赶出气泡，洒上buffer，铺上膜，建议两手各执其一端，一边先着陆，然后慢慢放下，有助于气泡的减少。铺胶亦如此。盖上滤纸，在上面加上少量buffer，推赶气泡；再分别盖上两张滤纸后，如前操作。最后加上另一块海绵，合好胶夹，并按正确电极方向插到tank中。因甲醇会影响身体健康，故此项操作都在通风橱中进行，但同时需注意避免湿的膜的变干。

  4.4.6 组装好电转仪，一般电转条件为72V，1hr。转膜时间的选择详见附表3。

  4.4.7 转好之后取出膜，做好标记，参照转膜判别标准，见附表6。在去离子水中振摇5min。尽量去除膜上水分，用丽春红染色5min， 用去离子水冲洗3次，再在去离子水中振摇10min即洗好。

  4.4.8 尽量去除膜上水分，在甲醇中处理5min后，常温下干燥20min以上。

附表1

附表2：膜尺寸=8.5cm×13cm，滤纸的尺寸=13.8cm×20.5cm。

附表3转膜时间

附表4

10×电泳缓冲液：0.25M Tris，1.92MGlycine，1%SDS。

10×电转缓冲液：0.25M Tris，1.92MGlycine。

附表5 不同浓度的分离胶封层所需正丁醇的量

附表6

根据长时间的转膜经验，在一直稳定的转膜条件下，在整个技术比较成熟时，转膜应该转到什么程度才是合格的。整理标准如下：8%胶的电转后Marker残留要求为零，10%胶的电转后Marker要求只能剩下淡淡的一条250kd的标准带。12%以上的胶都需要质检。

如下图代表的是一个电转区域

ABCD分别代表四块胶，蓝条代表四块胶上的Marker分布。胶下面的是膜。膜下的是电转夹子。合格的电转应该是每块胶上的蛋白都均匀的转到膜上。

电转区域根据Marker分布从左到右垂直方向，平分为3个区域， Marker A代表最左边的第一区域， Marker B.C代表中间的第二区域，Marker D代表最右边的第三区域。

如下表格所示：

如果Marker ABCD都转的符合上述标准，代表三个区域的电转都ok，膜ABCD可直接入库。如果Marker A未转好，代表第一区域未转好，那么即使Marker B转好，膜A.B也要要求质检；这时如果Marker C.D转好，膜C.D可直接入库。Marker D也是这种情况。

如果Marker B未转好，代表第二区域未转好，第二区域包括了所有的膜，那么即使Marker A.C.D转好，所有的膜都要求质检。Marker C也是这种情况。

1.       一孔梳子膜裁条后的预处理PVDF膜用100%甲醇浸泡20-30s，后用蒸馏水清洗4-5次，以去除甲醇。

2.        预处理的PVDF膜，倒去最后一遍蒸馏水后，直接放入含有 2-5%脱脂奶粉的 TBST中（脱脂奶粉要充分溶解在TBST中，不能有奶粉颗粒存在。判断方法：倒一些到少量水中，看看是不是溶液状态还是有细小的未溶解奶粉颗粒）。封闭时间：室温1h或4℃过夜封闭。封闭时摇床转速不要太快，以液面微微有晃动为准。

3.       封闭结束后，用TBST清洗3次，每次10min。摇床转速要让液面有明显晃动。

4.       清洗后，室温孵育一抗 1h。一抗提前用含有2-5%脱脂奶粉的TBST稀释好。

5.       一抗抚育后，用TBST清洗3次，每次10min。摇床转速要让液面有明显晃动。

6.       清洗后直接孵育二抗，室温孵育二抗 1h。 二抗提前用含有2-5%脱脂奶粉的TBST稀释好。

7.       二抗抚育后，用TBST清洗3次，每次10min。摇床转速要让液面有明显晃动。

8.       清洗后的膜放在曝光板上，去除多余的TBST液体，但不要膜变干。加上化学发光底物（底物的A液和B液要在室温放置几分钟， 之后再混合A液和B液）。底物在膜上反应3min后，吸掉多余的底物（标准为膜垂直，底物液体不下流为止）。多余的底物会发生反应发光和到处流动，造成背景发黑。在膜上盖上玻璃纸后，用纸巾轻轻擦拭玻璃纸，赶走玻璃纸和膜之间的气泡。同时，纸巾可以擦干玻璃纸表面的液体（液体会和X光胶片产生反应，导致显影结果变模糊）。进入暗室曝光。曝光时间：3min，1min，30s，10s，5s。

注：磷酸化抗体可以考虑用1-5% BSA TBST代替脱脂奶粉TBST。

TBST配方

1×TBST的终浓度为Tris:0.02mol/L ， Nacl:0.1mol/L ，吐温-20：0.1% ，pH值为7.4。

附溶液试剂配制：

  1×Hot lysis  Buffer:

         10mM Tris-Hcl(pH8)          

         1%SDS                         

         1.0mM Na-Orthovanadate      

        ddH₂O                      

  2×Sample Buffer:

         62.5mM Tris-Hcl(pH6.8)

         2% SDS

         0.01% Bromophenol Blue

         25% Glycerol:                    

         710mM ß-Merecaptoethanol:          

         ddH2O

4.2 制胶

  4.2.1 使用之前确保用具都是干燥和干净的，如果刚从烘箱拿出，要使所有用具先回复到室温。

  4.2.2 小心插入挡板，注意不要造成三明治的移动。灌胶前试插一下梳子。

  4.2.3 灌胶：选定合适的高度（使浓缩胶的宽度留有0.75cm-1cm）。配好分离胶，灌胶时速度要缓慢均匀，不要突然加快，并注意减少气泡；但也不要太慢，在胶凝聚之前结束灌胶。

  4.2.4 立即用正丁醇（正丁醇量请参照附表5）封住。分离胶凝固后（约40min-1hr），倾倒封层并清洗，尽量除去残留水分。制备堆积胶，按照配方配好除APS和TEMED的所需试剂，准备好梳子后，加入APS和TEMED，混匀后用10ml注射器灌到已凝固的分离胶的上面，一般每个分离胶需1.5ml，即注射器上三个刻度，立即斜插入梳子，以驱赶气泡，室温下凝固40-60min后即可用。

  4.2.5 梯度胶灌制：配制好4%的轻溶液55ml，20%的重溶液55ml，不用加入SDS，连接好灌胶器和梯度生成仪附件，把轻重溶液分别倒入梯度生成仪的轻重容器中，先打开灌胶器开关，然后打开轻重容器混合开关，等胶灌满灌胶器，关闭灌联并立即插入梳子。

 4.3 电泳

  4.3.1 Ag处理：加样前需在95-100℃水浴加热5min。细胞或组织裂解液（已预先定量总蛋白量为1mg/ml或2mg/ml）按每张胶200ug的量上样，如 一孔梳每孔200ug，两孔梳每孔100ug，10孔梳每孔20ug。若是重组蛋白，按每块胶200ng上样。

  4.3.2 装配好电泳装置，在Marker泳道加入4-5ul Protein Marker,加相应的lysate到上样泳道。

  4.3.3 内外槽加上预冷的电泳buffer，内槽注满，外槽加高于玻璃板底部位置。开始电泳，电泳条件一般为150V。 电泳时间根据Protein Marker的位置确定，一般14% 的胶溴酚蓝跑到胶底（未跑出）停止；10%的胶15KDa的marker跑出去（保留20KDa）停止；8%的胶25KDa的marker跑出去（保留37KDa）停止；6%的胶50KDa的marker跑出去（保留75KDa）停止。一般1h-1.5h。

4.4 电转

  4.4.1 在前一天即可准备电转buffer，含有10%甲醇的1×电转缓冲液配好后，置于4℃预冷过夜。

  4.4.2 在电泳结束前30min，按每4块电泳胶需2张膜四张滤纸算，准备好所需的滤纸数。把滤纸和海绵浸入电转buffer中备用。

  4.4.3 膜的处理，裁出合适大小的PVDF膜，以一定斜角慢慢浸入100%甲醇，务必使膜全部浸湿，处理20sec。处理时手不要去接触膜，用镊子接触膜，夹在膜的边缘处。倒去甲醇，去离子水换洗3次后，加水振摇2min。尽量倒尽水，将膜浸入电转buffer，注意浸没，平衡30min以上。

  4.4.4 此后撬开玻板取出胶，剔除浓缩胶，如有需要，可在分离胶的边角切角作为识别标志。如果是两孔梳，要求切出两孔。小心剥离出分离胶，置于电转buffer平衡40min。如果一次平衡很多胶，要求合理分开时间段，以使相同的胶的平衡条件尽量一致（以一个十二道电泳仪为单位，共十二块胶，先平衡4块胶，20min后再平衡剩下的8块胶）。

  4.4.5 预冷后，换上新手套，先在合适的载体上，如合适大小的盒盖，放好胶夹，阳极面朝下，铺上一张海绵，海绵不要沥的太干。在海绵上铺上一张滤纸，用玻棒推赶出气泡，洒上buffer，铺上膜，建议两手各执其一端，一边先着陆，然后慢慢放下，有助于气泡的减少。铺胶亦如此。盖上滤纸，在上面加上少量buffer，推赶气泡；再分别盖上两张滤纸后，如前操作。最后加上另一块海绵，合好胶夹，并按正确电极方向插到tank中。因甲醇会影响身体健康，故此项操作都在通风橱中进行，但同时需注意避免湿的膜的变干。

  4.4.6 组装好电转仪，一般电转条件为72V，1hr。转膜时间的选择详见附表3。

  4.4.7 转好之后取出膜，做好标记，参照转膜判别标准，见附表6。在去离子水中振摇5min。尽量去除膜上水分，用丽春红染色5min， 用去离子水冲洗3次，再在去离子水中振摇10min即洗好。

  4.4.8 尽量去除膜上水分，在甲醇中处理5min后，常温下干燥20min以上。

附表1

附表2：膜尺寸=8.5cm×13cm，滤纸的尺寸=13.8cm×20.5cm。

附表3转膜时间

附表4

10×电泳缓冲液：0.25M Tris，1.92M Glycine，1%SDS。

10×电转缓冲液：0.25M Tris，1.92M Glycine。

附表5 不同浓度的分离胶封层所需正丁醇的量

附表6

根据长时间的转膜经验，在一直稳定的转膜条件下，在整个技术比较成熟时，转膜应该转到什么程度才是合格的。整理标准如下：8%胶的电转后Marker残留要求为零，10%胶的电转后Marker要求只能剩下淡淡的一条250kd的标准带。12%以上的胶都需要质检。

          1.  把抗体对应的磷酸化和非磷酸化（乙酰化和非乙酰化）多肽，用1×TBS稀释多肽至5ng/ul,1ng/ul,0.1ng/ul,0.01ng/ul，稀释方法见表一。

2. 取各浓度的磷酸化和非磷酸化（乙酰化和非乙酰化）多肽稀释液1ul，按浓度由高到低次序在4cm×3cm的NC膜上分两列点样。同时，在每张膜边角处标记检样的项目号,膜上每列多肽为磷酸化（乙酰化）还是非磷酸化（非乙酰化）。

    3.膜干燥后，加入5%的脱脂奶粉（用1×TBST稀释）室温封闭1小时。

4.1×TBST淋洗3遍后,摇床上漂洗10min。准备孵育一抗。

5.抗体用5% NFDM/TBST稀释样品至1:1000。

    6.将每组膜对应放于2ml样品稀释液中，室温孵育1h。

    7.一抗孵育后，1×TBST漂洗膜，置于摇床上洗涤3次，每次10min。

    8.二抗室温孵育30min（1:1K稀释。）

    9.1×TBST漂洗膜后置于摇床上洗涤3次，每次10min。

 10.加底物及曝光。将膜放在带有荧光标记的小塑料板上（每组中的两条膜并列放置），400 ul /组ECL 底物（底物存放于4℃冰箱，须提前半小时放在室温预热），倒掉底物，将塑料板边沿靠在滤纸上，吸干余液，罩上透明塑料膜。

11.暗室曝光10s-3min（依情调整曝光时间以取得最佳效果）。