Western blot常见问题及分析
一、高背景（非目的条带处出现连续性弥散性条带）
分析高背景主要分为以下几种原因。
1.抗体原因
使用过高的抗体浓度，导致抗体存在非特异性结合。
通过稀释抗体，降低一抗或二抗的浓度，或者通过梯度稀释抗体选择合适的抗体浓度。
2.膜及试剂选择本身问题
封闭液选择不当：脱脂牛奶及动物血清可能与不同一抗产生交叉反应，或者封闭液中含有生物素等原因导致非特异性显色。
3.缓冲体系选择不当
①磷酸盐缓冲液（PBS）会干扰碱性磷酸酶的活性，当使用碱性磷酸酶，应避免使用含有磷酸盐的试剂。
②检测磷酸化蛋白时，避免使用磷酸盐缓冲液（如 PBS）和含磷蛋白的封闭剂。
4.膜污染导致背景值过高
①通过避免膜污染，全程使用干净镊子。
②换一张新膜用足够的液体，避免操作过程中膜干燥。
③实验中避免膜之间相互干扰，防止膜表面相互摩擦等物理损伤。
④选择合适孔径的纤维素膜。
5.实验流程问题
①非特异性位点的不充分洗涤。
②增加封闭液中的蛋白浓度。
③优化封闭时间和温度。在室温下封闭1-2 小时，或 4 ℃过夜。
④漂洗不充分导致背景过高，增加漂洗次数和漂洗缓冲液的体积。
⑤在封闭液中添加去垢剂帮助减少背景，去除非特异性结合。选择合适浓度的去垢剂可以有效降低条带背景。
⑥化学发光底物的信号太强。
⑦减少印迹曝光时间，减少较弱信号的显色程度。
⑧当显色过于灵敏时，可以换用灵敏度更低的底物。
⑨优化膜与底物的孵育时间等。
⑩调整一抗，二抗孵育时间，避免孵育时间过长。
二、无信号或微弱条带
1.没有信号是常见的抗体使用问题，需要根据具体的情况进行分析：
①确认检测靶点在样本中的表达情况。一般来说，常见的蛋白可以在BioGPS中进行查询，但注意，该网站罗列的是蛋白转录水平的表达量，与实际翻译产生的蛋白水平会有出入，仅能作为参考。低表达量的蛋白，在能检测到的情况下，可以提高抗体的稀释浓度来改善。
②分泌型蛋白：在细胞的正常表达中，会分泌到细胞外，胞内残留的蛋白含量比较少，这种时候，建议用含有蛋白的阳性样本（比如组织）作为对照进行比对，判断是蛋白含量低还是抗体特异性的问题。
③磷酸化蛋白，以及一部分蛋白需要进行药物的刺激，才能在样本中高表达，这种情况下，一般客户可能没有阳性样本，需要客户提供参考文献作为说明，我们根据参考文献中的具体报道，进行问题的判明。有时候，客户会忽视文献中样本的处理步骤，导致反馈的产生。
2.抗体原因
①一抗及二抗本身活性问题，例如抗体试剂本身活性不足，抗体不在保质期，抗体反复使用，抗体存在污染，抗体使用浓度不合适等；可以通过选择有质量保证和活性验证的抗体试剂，按照说明书进行操作。
②一抗和二抗问题一不能相互识别，例如一抗选择鼠源抗体，二抗选择抗兔抗体或识别其他物种抗体，导致二抗与一抗不能相互结合。
3.样品问题
①感兴趣的蛋白质不存在。
②通过前期调查，确认样品中是否含有目的蛋白。
③组织或细胞系中的蛋白表达水平是够较低。
④样品中蛋白质不足。
⑤确保每条泳道至少上样 20–30 µg 蛋白质，使用蛋白酶抑制剂，避免样品提取过程中降解，例如磷酸化蛋白检测实验，蛋白提取过程中，需要添加磷酸酶抑制剂避免样品降解。⑥每次实验设置合适的系统对照，排除其他因素的影响。
⑥蛋白提取样品裂解不足。
⑦确保细胞中较难提取的膜结合和细胞器（如胞核和线粒体）的含量较少的蛋白过程中，确保样品被充分裂解是必不可少的。
⑧样品防止时间太久，导致样品降解，或者蛋白沉积等。
⑨样本制备的问题。虽然很多时候，冻融过的样本可以进行重复，但是仍然有蛋白（例如小分子蛋白，分泌型蛋白等），在冻融之后，会大量降解，造成原本可以做出来的结果，无法重复，这种时候，我们一般会建议客户进行新鲜样本的制备和检测。
⑩在裂解细胞或者组织时，选择合适的裂解液也十分重要，常见的RIPA裂解液适用广泛，但是对于膜蛋白或者核蛋白，我们建议用专门提取此类蛋白的protocol进行样本制备，以达到目的蛋白的大量收集。
三、非特异性或弥散条带
1.抗体原因
①抗体浓度过高 通过降低一抗使用浓度，降低非特异结合信号。使用经试验验证过的一抗。更换特异性更好的抗体。
②二抗非特异结合导致的背景信号，减少二抗使用浓度，特别是 HRP 或 AP 标记二抗的浓度。
③选择经交叉验证的二抗。避免使用物种相近，同源性高的物种产生的一抗。
2.样品原因
①凝胶孔上样量过高需要减少加入的样品量，减少样品的非特异性。
②化学发光底物的信号太强减少印迹的成像或曝光时间。
③蛋白存在不同亚型，或者变体，包含不同分子量同工蛋白，或者蛋白存在多聚体形式，还原不充分等，在上样品需要充分还原样品。
缩短膜与底物的孵育时间。
④造成弥散性条带可能是电压过高，迁移速度过快，电泳温度过高等导致。
四、条带呈反白色
当条带出现反白情况，往往是抗体浓度过高，底物被迅速消耗，在检测时剩余的光信号降低，在蛋白成像时导致中间低周围高，形成空心样品，或者白色样品，将抗体稀释至最佳浓度。
五、拖尾效应
①糖基化蛋白：不同的糖基化导致分子量高于预测的分子量处产生条带拖尾效应。
②样品降解：样品中的蛋白酶抑制剂等有助于防止蛋白降解。裂解物的长时间存放导致蛋白降解物增加，在分子量低于预测分子量时出现拖尾效应。
③裂解不完全或者样品溶解度不好，优化蛋白样品提取方法，寻找合适的裂解方式。
④电泳缓冲液重复利用次数过多，消耗过多的盐溶液。
⑤分离胶浓度不合适，导致蛋白分离效果不理想。
六、散斑或斑点样印迹
①转移海绵污染，当转移海绵使用后没及时痛风晾干，可能生长真菌等板块。
②缓冲液污染，使用次数过多的缓冲液或者防止过久导致微生物滋生，使这些点状物显色在膜上形成斑点。
③封闭液溶解不充分，例如脱脂牛奶未溶解充分，含有颗粒样团块，导致封闭不完全。
七、条带出现笑脸状
①迁移期间电压可能过高。未根据蛋白分子量选择合适的电压，导致蛋白迁移过快。
②电压太高，迁移速率太快，导致出现边缘效应，检查建议电压的协议，选择合适电压条件。
③凝胶在迁移过程中可能太热。如果温度过高，缓冲液的 pH 值可能会发生变化，导致蛋白迁移环境收到影响，可以在冰上后者4℃条件下进行电泳，保证环境温度。
④凝胶时间不充分，胶内部冷却密度不均匀或者甲醇浓度较低，可以适当提高甲醇浓度。
Q: 背景深怎么解决？
A: 常用的封闭液是5%脱脂奶粉以及3%BSA，封闭时间1h居多，更换封闭液，以及延长封闭时间可以改善一部分的高背景。同时高背景也可能是由于一抗的稀释浓度过高，造成的信号过强，在有阳性带的情况下，可以适当降低稀释浓度，从而降低背景。
磷酸化的抗体一般建议使用BSA进行封闭和孵育，牛奶中的酪蛋白由于其磷酸化的特异性，会产生非特异信号，并且所有的抗体都建议在4℃条件下孵育，室温孵育也会造成高背景。
商用体系的影响。一些商用体系的封闭液，或者稀释液，对抗体的使用同样会有影响，一般我们生产和验证抗体的使用的是传统的脱脂奶粉或者BSA进行封闭和稀释。为了保证大部分人的使用习惯，我们不会使用不同的商用体系进行验证，这也意味着如果使用商用体系出现了抗体使用问题，我们一般会建议客户进行体系的更换，改用BSA或者脱脂奶粉，通常来说，封闭液和稀释液应该用相同的体系，从而防止交叉反应，影响信号曝光。
Q: 特殊样本如何处理？
A: 脑组织属于多脂质特殊组织，建议用液氮研磨组织，用强力的蛋白提取液提取蛋白，防止蛋白降解（全程冰上操作，蛋白提取液要预先预冷。不要4℃放置太长时间）。在4℃旋转混合仪上进行充分裂解30min，裂解液要充分离心4℃，15000rpm，30min。小心的避开脂质层，取上清再加足量或者过量的Laemmli buffer，95℃，10-20min加热变性，如果看不见明显的脂质层，可以将离心时间延长。
核蛋白和膜蛋白，大部分这类蛋白的内源性表达量比较低，需要通过专门提取的方式进行富集，然后裂解得到待测样本，这种类型蛋白的提取Kit商业应用已经很成熟，国内可供选择的品牌也很多。
Q;Marker有信号，怎么解决？
A:由于抗体识别的抗原表位几乎无限多，预染Marker的本质也是多种分子量不同的融合蛋白，抗体可能会识别这些蛋白，从而在显影时出现信号。一般来说单克隆抗体可以解决一定程度的问题，但是在抗体识别出特异性抗原的情况下，可能会影响信号的显影，我们建议裁掉Marker，加强目的条带的曝光程度。
Q;条带跑出来弥散，不成带型？
A:考虑分离胶和浓缩胶的配方是否出现了问题。Tris-HCl这一类的缓冲液，APS促凝剂等等，随着配制时间，保存时间的推移，可能会产生pH值失衡，药物药性失效，导致制备凝胶时出现问题。例如，APS失效会引起凝胶凝固时间变长，正常条件下20分钟以内可以凝固，可能会延长到30到40分钟，这种情况会影响条带分离的成型。
Q;曝光显出多个条带是杂带吗？蛋白大小跟报道的分子量不一致是不是非特异带？
A:杂带，以及条带位置不符合预期，作为同样常见的问题，需要分开讨论：
1.蛋白的转录后，以及翻译后修饰。最常见的引起杂带的原因，是在转录后，由于选择性剪切，同一个转录本，会翻译出不同大小的蛋白，这类蛋白称为该蛋白的剪接体，在UniProt查询蛋白时，可以在sequences看到有多少个报道过的Isoform。每个剪接体对应的变化，是否影响了客户需要研究的domain，需要客户进行比对，从而判断自己需要研究的主带是哪一条，或者哪几条。文献中的有些蛋白，在报道时的western图片，也会有双条带，或者多条带，这些都是可以解释和讨论的，western并不一定是只有一条带，才是好看的图片，要符合实际，才是真实的数据。
2.蛋白在翻译完成后，可能会进行各类修饰，引起蛋白大小明显改变的多为糖基化修饰。在一些分泌型蛋白和膜蛋白上，糖基化位点的存在会将一个蛋白的大小增加至两倍或者更多，且由于组织的特异性，同一个蛋白在不同样本中的糖基化修饰差别很大。同时，有的蛋白存在前体和成熟体。
3.这种情况比较偶发，就是在培养的细胞状态不是很好，或者传代过多的情况下，由于基因组的改变，细胞会表达某种蛋白的截短蛋白，这种剪接体可能是没有被报道过的，但由于抗体的特异性被识别出来，但一般可以通过膜的剪裁避免。
4.蛋白等电点。蛋白质本身是有电荷的，当处于某一个pH值时，蛋白质电荷会被中和，那么该处的数值我们称为等电点pI。大部分的蛋白质的等电点小于6，所以我们在中性的电泳环境中，蛋白因为等电点小于pH值，因此带负电荷，而电泳是蛋白从负极向正极迁移的过程，带负电的蛋白在电场中，不会受到阻力。但是有的蛋白等电点比较大，大于7甚至接近8，这时，由于电泳条件不足以中和电荷，使得蛋白质带正电，在电场中迁移受到阻力，由此产生蛋白分子量变大的错觉，因此marker仅能作为参考，而实际的主带仍然要结合蛋白特性进行判断。
5.样本保存和冻融。反复的冻融，或者蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂失效，会造成蛋白质的降解，引起多条带的情况出现，但这种情况一般是以“拖尾”的形式居多。另一种情况，大分子的蛋白本身会发生降解，但是由于观测的条带在比较大的marker附近，降解的较小片段在实际裁膜过程中，基本检测不到。同时，煮沸蛋白的时间不够，冻融后没有煮，会造成蛋白形成同源多聚体的形式，在目的大小两倍，或者多倍的地方出现条带。