1.脱蜡水化

置烘箱60℃烤片至切片石蜡融化        1h

立即放入100%二甲苯至石蜡脱尽       10min×2

100%酒精        5min×2

95%酒精       5min×2

85%酒精 5min×2

75%酒精 5min×2

清水浸洗（微振动）     3次(每次30秒)

2.抗原修复

将修复液置于染色盒内(每架切片配200ml 修复液).放入盛有230ml水的电饭锅内,按下煮饭扭/或者高压锅  30min（高压锅15min）

电饭锅跳掉后,取出染色盒,室温冷却   30min

自来水冲洗,蒸馏水浸洗（微振动）    2minX 3次

3.封闭内源性过氧化物酶                                  

3%双氧水（30%H2O2，蒸馏水稀释）        10min

蒸馏水浸洗（微振动）         5minX 3次

4.羊血清封闭

把冷藏的羊血清取出室温放置     15min

用免疫组化笔把每孔组织圈起来防止液体外流        

TBST浸洗组织或PBS     1次

每孔组织70ul羊血清封闭    30min

TBST浸洗组织        1次

5.一抗孵育

抗原组织         4℃，过夜(约14小时)或37℃，1h

阳性对照         Vimentin （++，+）

阴性对照         清水

TBST漂洗（摇床，中速）    5minX3次

6.二抗孵育

湿盒复温，并把冷藏的二抗取出室温放置         15min

羊抗兔二抗

50μl/抗原组织，孵育  30min，37℃

TBST漂洗（摇床，中速）    5minX3次

7.DAB显色

DAB配置按试剂盒配置 使用现置

DAB100μl/抗原组织      45s

蒸馏水冲洗     1次

蒸馏水浸洗（中度振动）     2次

8.苏木素复染

苏木素复染     1-2.5min

清水浸洗         3次

TBST泛蓝        1次10-20s

清水浸洗         2次

9.封片

75%酒精 1minX2

95%酒精       1minX2

100%酒精        1minX2

100%二甲苯    5minX2

中性树脂封片        

抗原修复液：  

柠檬酸钠缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0）

（二水合）柠檬酸三钠 2.94 g，混合溶解于水中，用 1M HCl 调节 pH 至 6.0。加入 0.5 mL Tween-20 并充分混合，可在室温下储存 3 个月或在4 ℃ 下长期储存

Tris-EDTA 缓冲液（10 mM 三羟甲基氨基甲烷，1 mM EDTA 溶液，0.05% Tween 20，pH 9.0）

三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 1.21 g，EDTA 0.37 g，混合溶解于水中，调节 pH 至 9.0（通常为9.0）。加入 0.5 mL Tween-20 并充分混合，可在室温下储存 3 个月或在 4 ℃ 下长期储存。

1 mM EDTA，pH 8.0

EDTA 0.37 g，溶解于水中，用 NaOH 将 pH 调节至 8.0。室温下可储存 3 个月